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    活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例

    發(fā)布時(shí)間: 2010/7/13  點(diǎn)擊次數(shù): 1660次
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    活體光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)技術(shù)與熒光(fluorescence)技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA,今天,生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上,使對基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實(shí)。而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP, Cyt及dyes等)進(jìn)行標(biāo)記,利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號。研究人員能夠利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。
        該技術(shù)可被廣泛應(yīng)用于標(biāo)記細(xì)胞或基因的示蹤及檢測;基因治療在活體動(dòng)物體內(nèi)直接的觀察和檢測;基因組、蛋白組學(xué)、藥學(xué)及生物技術(shù)在活體動(dòng)物內(nèi)的研究;藥物及化學(xué)合成藥物的藥物代謝及毒理學(xué)監(jiān)測;食品菌落生長成像;皮膚醫(yī)學(xué)中皮膚疾病的體內(nèi)成像;法醫(yī)鑒定;微孔板成像,例如:免疫分析、報(bào)告基因、基因探針和嗜菌作用分析等;熒光團(tuán)的體內(nèi)成像,例如:Alzheimer疾病研究中結(jié)合嗪的β-淀粉沉淀物分析;轉(zhuǎn)基因植物中通過報(bào)告基因?qū)ι碇芷诠?jié)奏的研究;凝膠成像分析等等。
        但在研究過程中,研究者們必須事先用基因技術(shù)進(jìn)行熒光素酶基因標(biāo)記,或者某種熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。目前活體光學(xué)成像系統(tǒng)的制造商,如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等,不僅為客戶提供先進(jìn)的儀器,也提供具體實(shí)驗(yàn)所需的整套解決方案,包括試劑、實(shí)驗(yàn)手冊、特殊用途的質(zhì)粒、細(xì)胞株、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞處理和動(dòng)物處理設(shè)施等配套。出色的多任務(wù)處理能力,人性化的整體設(shè)計(jì),便捷的操作系統(tǒng),使實(shí)驗(yàn)室影像分析領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。

        下面以研究干細(xì)胞活體移植后的存活率為例,簡介一兩種內(nèi)源性熒光色素標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)方法,供專業(yè)人士參考。

    用熒光色素DiD標(biāo)記 間充質(zhì)干細(xì)胞
    1. 先用胰蛋白酶消化待標(biāo)記材料,使之成為一定密度的懸浮液;
    2. 從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出間充質(zhì)干細(xì)胞,吸取含原有培養(yǎng)基的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行標(biāo)記;
    3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS (不含鈣鎂離子的磷酸緩沖液)清洗細(xì)胞,吸去PBS, 鈣鎂離子會影響胰蛋白酶的活性,必須小心;
    4. 加入預(yù)熱的0.05% 胰蛋白酶液,加液量以T75型瓶為例,每瓶加5ml, 確保瓶的表面被*覆蓋;
    5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37° C 孵育約 5 分鐘;
    6. 然后在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞已經(jīng)*分散,如果有細(xì)胞貼壁情況,輕拍若干次或延長孵育時(shí)間直至酶解消化*成功;
    7. 加入等量含 10% FCS的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶;
    8. 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
    9. 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;
    10. 400 RCF離心5 分鐘;
    11. 小心移去上清液,不要擾動(dòng)細(xì)胞;
    12. 將細(xì)胞重新懸浮于DMEM 并進(jìn)行計(jì)數(shù);
    13. 需要待標(biāo)記細(xì)胞在無血清DMEM溶液中的密度應(yīng)為1x106 /ml ;
    14. 每ml細(xì)胞懸浮液加入5 µL DiD 染色液;
    15. 用移液器將染色液與細(xì)胞懸浮液混合均勻;
    16. 在6孔低附著性細(xì)胞板上37 °C 孵育20分鐘;
    17. 孵育*后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中;
    18. 400 RCF離心5 分鐘;
    19. 小心移去染色液,不要擾動(dòng)細(xì)胞;
    20. 用PBS清洗細(xì)胞,用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
    21. 重復(fù)洗三次;
    22. 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;
    23. 可以進(jìn)行活細(xì)胞成像了!

    用熒光色素ICG標(biāo)記 人胚胎干細(xì)胞
    1. 必須先準(zhǔn)備好吲哚菁綠溶液(血容量、心輸出量、肝功能測定劑)作為對照品 ,然后使之與轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白(抗凝血作用)混合;
    2. 測出1ml吲哚菁綠溶液的活力,然后在100 µL DMSO中溶解ICG;
    3. 向混合物中加入 400 µL Dulbecco的改良Eagles 培養(yǎng)基 (DMEM + 10% 胎牛血清), 震蕩均勻,吲哚菁綠溶液終濃度為2mg/ml;
    4. 加入轉(zhuǎn)染試劑魚精蛋白,魚精蛋白作為對照品的載體,使之能夠有效進(jìn)入細(xì)胞;
    5. 在300 µL ICG 和 300 µL 無血清Dulbecco改良 Eagles 培養(yǎng)基中混入 5 µL 硫酸魚精蛋白溶液, 使之終濃度為 10mg/ml,;
    6. 震蕩5分鐘使之形成復(fù)合物,標(biāo)記溶液制備完畢;
    7. 從 hESC 10mm Petri 培養(yǎng)皿中移去原有培養(yǎng)基;
    8. 加入5ml預(yù)熱的 DMEM;
    9. 加入制備好的魚精蛋白/ICG 溶液, 37 °C下孵育1h;
    10. 孵育*后移去染色液;
    11. 用5 ml PBS漂洗培養(yǎng)皿以清除染色液;
    12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液,37 °C下孵育5分鐘使之酶解,適當(dāng)震搖培養(yǎng)皿效果會更好;
    13. 用移液器反復(fù)吸取幾次確保細(xì)胞均勻分散;
    14. 加入等量含 10% KSR的培養(yǎng)基中和胰蛋白酶;
    15. 然后移取細(xì)胞懸浮液至15ml 已滅菌的有蓋聚丙烯離心管中,400 RCF離心5 分鐘;
    16. 在全培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞;
    17. 如果還有細(xì)胞團(tuán)塊,可以移去原有培養(yǎng)基用10ml預(yù)熱的全ESC培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞,重復(fù)酶解再離心;
    18. 在這一點(diǎn)上,鼠源飼喂細(xì)胞需從hESCs中分離;
    19. 然后將細(xì)胞懸浮液移至涂布瓊脂的10 cm 培養(yǎng)皿中;
    20. 37 °C 孵育 45 分鐘,注意不要晃動(dòng)培養(yǎng)皿,如此鼠源飼喂細(xì)胞會貼壁而干細(xì)胞保持懸浮;
    21. 從Petri 培養(yǎng)皿中移出已標(biāo)記的單細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞懸浮液;
    22. 細(xì)胞重新計(jì)數(shù)并用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性;
    23. 可進(jìn)行活細(xì)胞成像了!
     

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