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    測序常見問題及其分析

    發(fā)布時(shí)間: 2010/4/15  點(diǎn)擊次數(shù): 2697次
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     1、PCR產(chǎn)物測序時(shí)出現(xiàn)重疊峰

      問題圖1(模板中有堿基缺失,往往是單一位點(diǎn)(1-1)或兩個(gè)位點(diǎn)(1-2)堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼)

      圖1-1

      圖1-2

      解決方法:將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒(如T載體)中挑單克隆測序,或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進(jìn)行測序。

      問題圖2(PCR產(chǎn)物不純,含部分序列一致的兩種以上的片段,長度不一)

      圖2

      解決方法:主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化,含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化(至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化)后再進(jìn)行測序,便可解決。

      問題圖3(測序引物有堿基缺失)

      測序引物有堿基缺失(一般是引物的5'端缺失),和模板的堿基缺失即圖1有些類似,所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼,而引物堿基缺失的話,則從測序一開始就出現(xiàn)移碼,表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。

      解決方法:重新合成引物,或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化

      2、克隆測序時(shí)出現(xiàn)峰形重疊

      原因:所挑選的重組子不是單克隆,所提供的測序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒;或是是送測序的菌液污染

      解決方法:重新挑單克隆的菌落(劃線分離單菌落),提質(zhì)?;蛩途涸俅螠y序。

      3、樣品有雜合/突變位點(diǎn)

      模板中有雜合型突變,也就說模板本身在這個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)突變;或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點(diǎn)。如果模板有雜合(突變或缺失),那么測序圖形中其他的位點(diǎn)一般都是單一的峰形,然后突然在某一個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。

      解決方法:建議將DNA片段克隆到載體再測序。

      4、polyA/T和C/Gcluster導(dǎo)致的套峰和測序信號衰減

      圖4-1

      圖4-3

      圖4-4

      RACE測序時(shí)經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形,解決方法:從另一端測序;但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間,呵呵,目前還沒有很好的解決方法,要看測序公司的本事了。

      C/Gcluster在PrV基因組測序時(shí)遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了,雖然不喜歡鬼子,但有時(shí)候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服務(wù)。

      5、基因中含有重復(fù)序列

      可能的原因:樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣,會(huì)導(dǎo)致Frame滑動(dòng),較短的重復(fù)序列會(huì)導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)移碼;而較長的重復(fù)序列會(huì)使定序信號衰減。

      解決辦法:反向測序有時(shí)能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域(但不是一定都能夠),通過多次的測序結(jié)果比對,拼接可以得到全序列結(jié)果。

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