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    公司對葡萄糖-6-磷酸酶染色液(鉛法)操作方法

    發(fā)布時間: 2015-01-12  點(diǎn)擊次數(shù): 1642次

    產(chǎn)品簡介:
    葡萄糖-6-磷酸酶染色液是一種多存在于哺乳類動物肝、腎、腸等組織的膜結(jié)合酶,G-6-Pase 和微體緊密結(jié)合,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要標(biāo)志酶,能把葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖和磷酸。G-6-Pase 對維持血糖濃度的相對恒定有至關(guān)重要的作用,是糖代謝的關(guān)鍵酶。當(dāng)血糖降低時,G-6-Pase 促進(jìn)肝糖原轉(zhuǎn)變?yōu)檠恰.?dāng)缺乏G-6-Pase 時,會引起糖原分解障礙,使糖原積累在肝、腎、心臟等部位,導(dǎo)致肝糖原儲積病。G-6-Pase zui適pH 為6.5,在pH6.0~8.0 亦可,pH8.0 zui穩(wěn)定,pH5.0易變性。組織化學(xué)反應(yīng)多用pH6.5~6.7。
    葡萄糖-6-磷酸酶染色液(鉛法)采用重金屬捕捉劑和磷酸結(jié)合顯示酶的活性。該酶對固定很敏感,組織經(jīng)80%乙酸溶液固定后用石蠟包埋,G-6-Pase *被抑制。需用新鮮組織低溫恒冷切片,經(jīng)甲醛短時固定酶即失活,但可短時低溫丙酮固定,但一般不固定。
    操作步驟(僅供參考):
    1、冰凍切片入蒸餾水清洗。
    2、入G-6-Pase 孵育液,37℃孵育15~20min。
    3、自來水沖洗后,蒸餾水沖洗。
    4、在上述過程中配制ALP 硫化工作液,即取試劑(B)用蒸餾水稀釋50 倍, 即為ALP 硫化工作液,即配即用。切片入硫化工作液,孵育1min。
    5、自來水水洗3~5min。
    6、(可選)入中性福爾馬林,固定2min。
    7、入蒸餾水水洗2 次。
    8、甘油明膠封片

    鉛法:葡萄糖-6-磷酸水解后所釋放出磷酸,為*所捕獲,經(jīng)硫化銨處理,zui終反應(yīng)產(chǎn)物為顆粒狀的硫化鉛沉淀。反應(yīng)通式如下:
     
    葡萄糖―6―磷酸鈉+H2 O 葡萄糖 -6- 磷酸酶 葡萄糖+磷酸 Pb(NO3 )2 Pb3 (PO4 )2  (NH4 )2 S PbS↓
     
     1)孵育液配制(新鮮配制)
      0.125%葡萄糖―6―磷酸鈉                       4ml
      0.2mol/LTris-順丁烯二酸鹽緩沖液(pH 7.4)       4ml
      2%Ph(N03 )2 (2.5%)                              0.6ml
      蒸餾水                                          1.4ml
      充分混合后使用
     
        2)染色程序:
        ①新鮮組織冰凍切片;
        ②10%福爾馬林固定5分鐘后水洗;
        ③切片入孵育液中,37℃孵育20分鐘水洗;
        ④人1%硫化銨水溶液中1分鐘水沖洗;
        ⑤3%福爾馬林后固定10分鐘;
        ⑥甘油明膠封固。
     
        3)結(jié)果:酶活性處顯棕色。
     
        4)對照實(shí)驗(yàn):①除去底物;②以F―甘油磷酸鈉代替底物;③以0.01mol/L氟化鈉作為抑制劑。

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