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    公司對雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析*

    發(fā)布時間: 2014-09-04  點擊次數(shù): 1697次

    公司對雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析*實驗原理

    本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。用純化的雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入腫瘤壞死因子α(TNF-α),再與HRP標(biāo)記的腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。 

    試劑盒組成 

    1

    30倍濃縮洗滌液

    20ml×1瓶

    7

    終止液

    6ml×1瓶

    2

    酶標(biāo)試劑

    6ml×1瓶

    8

    標(biāo)準(zhǔn)品(128ng/L)

    0.5ml×1瓶

    3

    酶標(biāo)包被板

    12孔×8條

    9

    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    1.5ml×1瓶

    4

    樣品稀釋液

    6ml×1瓶

    10

    說明書

    1份

    5

    顯色劑A液

    6ml×1瓶

    11

    封板膜

    2張  

    6

    顯色劑B液

    6ml×1/瓶

    12

    密封袋

    1個

    公司對雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析*標(biāo)本要求 

    1.標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融

    2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

    操作步驟

    標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進(jìn)行稀釋。

    64ng/L

    5號標(biāo)準(zhǔn)品

    150μl的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    32ng/L

    4號標(biāo)準(zhǔn)品

    150μl的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    16ng/L

    3號標(biāo)準(zhǔn)品

    150μl的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    8ng/L

    2號標(biāo)準(zhǔn)品

    150μl的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

    4ng/L

    1號標(biāo)準(zhǔn)品

    150μl的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入150μl標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

     

     

    加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
    溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
    配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
    洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
    加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。 
    溫育:操作同3。
    洗滌:操作同5。
    顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘.
    終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn))。
    測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

    操作程序總結(jié):

     

     

    計算

      以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。 

    注意事項

    1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

    2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

    3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

    請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
    封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    6.底物請避光保存。

    7.嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

    8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

    9.本試劑不同批號組分不得混用。

    公司對雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫分析*保存條件及有效期

    1.試劑盒保存:;2-8℃。

    2.有效期:6個月

     

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