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    研域生物帶你繞開ELISA試驗(yàn)中呈現(xiàn)的各種問題

    發(fā)布時(shí)間: 2019-06-11  點(diǎn)擊次數(shù): 1349次

    ELISA是蛋白定量的金規(guī)范,也是免疫學(xué)研討中常用的試驗(yàn)辦法之一。很多人覺得ELISA很簡(jiǎn)單,其實(shí)不然。今天研域生物帶你繞開ELISA試驗(yàn)中呈現(xiàn)的各種問題,輕松搞定ELISA試驗(yàn)~

     

    1.間接法

    檢測(cè)抗體常用的辦法, 首要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)。
    優(yōu)勢(shì):二抗能夠加強(qiáng)信號(hào),并且有多種挑選能做不同的測(cè)定剖析。不加酶符號(hào)的一級(jí)抗體則能保存它多的免疫反應(yīng)性。
    缺點(diǎn):交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高

    2.雙抗體夾心法

    檢測(cè)大分子抗原常用的辦法。
    優(yōu)勢(shì):高活絡(luò)、高專一性,抗原無須事前純化。
    缺點(diǎn):抗原必定得具有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。

    3.競(jìng)爭(zhēng)法

    檢測(cè)小分子半抗原(藥物、激素等)。
    優(yōu)勢(shì):可適用比較不純的樣本,并且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。
    缺點(diǎn):整體的敏感性和專一性都較差。

    常見問題剖析

    Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱,樣本顯色

    溶解規(guī)范品以及倍比稀釋時(shí),未渦旋震動(dòng)或不行充沛。
    規(guī)范品溶解、倍比稀釋時(shí)均需求渦旋震動(dòng)以保證充沛混勻。單純依托移液器重復(fù)吹打,效率較低、作用也不必定jia。

    Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

    在孵育階段靜置在桌面上,這樣非常不利于抗原抗體之間的充沛接觸,導(dǎo)致顯色偏弱。
    推薦孵育階段,運(yùn)用ELISA的微孔板振蕩器,調(diào)至適宜的頻率,使抗原抗體充沛接觸,保證結(jié)合作用。假如排除上述原因,有可能是漏加了某個(gè)組分,如檢測(cè)抗體、酶等。關(guān)于比較大意的新手,必定要做好符號(hào)和記錄,或者運(yùn)用增加染料的ELISA試劑盒。

    Q3.標(biāo)曲顯色,樣本不顯色

    當(dāng)樣本中意圖蛋白濃度極低或者樣本中攪擾要素較強(qiáng),就無法檢測(cè)到。現(xiàn)在ELISA仍然是蛋白檢測(cè)活絡(luò)度gao的辦法,與不同技能結(jié)合后,衍生出了多種類型的ELISA,提高了檢測(cè)活絡(luò)度。

    關(guān)于意圖蛋白濃度特別低的樣本,能夠嘗試用高敏ELISA,但這也并不意味著必定能檢測(cè)到樣本濃度,只能說能夠提高樣本的可測(cè)率,并使成果愈加牢靠。因?yàn)橥ǔS靡话鉋LISA檢測(cè)的樣本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高樣本OD值,使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi),得到的數(shù)值也愈加可信。

    Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色,但復(fù)孔的CV大

    這個(gè)問題就跟移液器和試驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的運(yùn)用維護(hù)不規(guī)范,就會(huì)造成移液的誤差較大;試驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對(duì)復(fù)孔的CV也有很大影響。
    掌握移液器的正確運(yùn)用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可操練移液動(dòng)作、加快速度,保證移液的精密度。

    Q5.本底偏高,樣本值測(cè)不到標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(關(guān)于高敏ELISA能夠恰當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)分,本底過高會(huì)掩蓋意圖信號(hào),導(dǎo)致無法測(cè)到樣本值。
    在參加TMB顯色后,需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯se狀況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色,即可停止反應(yīng)。

    Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋,核算得到的樣本值差異較大

    有時(shí)分咱們不清楚樣本中意圖蛋白的濃度怎么,應(yīng)該怎么稀釋,那么咱們就會(huì)做下預(yù)試驗(yàn),確認(rèn)稀釋倍數(shù)。但是有時(shí)分同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后,核算得到的樣本值之間差異較大,應(yīng)該挑選哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢?

     

    這里觸及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí),血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸,基質(zhì)效應(yīng)較顯著。而經(jīng)過稀釋后,攪擾要素也隨之稀釋,影響就會(huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后,核算得到的樣本值挨近時(shí),咱們就能夠以為在該稀釋梯度時(shí),樣本中的攪擾要素影響較小,核算得到的值也是挨近真實(shí)的。但是這樣的稀釋是針對(duì)意圖蛋白濃度較高的樣本而言。關(guān)于濃度很低的樣本,經(jīng)過多倍稀釋后,就愈加測(cè)不到了,此刻可依照廠家說明書推薦的加樣方法操作。

    Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

    除非是共用的試劑如洗液、檢測(cè)緩沖液,其它組分不建議用其它試劑盒的組分,乃至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包含規(guī)范品、規(guī)范品稀釋液、檢測(cè)抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的,假如輕率運(yùn)用其它試劑盒的組分,有可能對(duì)成果產(chǎn)生影響。

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