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    人胚胎生殖細胞體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化及細胞移植實驗方法

    發(fā)布時間: 2011-04-11  點擊次數(shù): 2330次

    1.1   主要試劑   DMEM培養(yǎng)基 (GIBCO/BRL 、高糖)、胎牛血清(fetal calf serum , FCS , Hyclone)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF , R&D公司)、白血病抑制因子(LIF,R&D公司)、培養(yǎng)液A:DMEM液(高糖)+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 鏈霉素、培養(yǎng)液B:DMEM液(高糖)+15%胎牛血清+0.1 mol/Lβ-巰基乙醇+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 U/L 鏈霉素 +1000 U/ml hLIF +1 ng/ml bFGF[30]、胰蛋白酶(Sigma)及EDTA、MAB-1281(小鼠抗人細胞核單克隆抗體,CHEMICHON)、正常山羊血清 (博士德公司)、EnVision檢測試劑盒(GK500705,Gene Tech, 盒中包括通用型二抗,DAB及稀釋液)。

        1.2   胚胎來源   收集蘇州大學(xué)附屬第二 醫(yī)院 婦產(chǎn)科,蘇州市婦幼保健中心人工中止妊娠的5~10周人胚,每例胚胎均經(jīng)孕婦和道義委員會同意,胚胎需完整,無嚴重污染。

        1.3   人EG細胞的原代培養(yǎng)   取5~10周流產(chǎn)胚胎,在流產(chǎn)后6 h內(nèi),于超凈工作臺內(nèi),用含雙抗(400 U/ml青霉素、400 U/ml鏈霉素)的無Ca2+、Mg2+的PBS沖洗胚胎,將胚胎移入無菌培養(yǎng)皿,打開胚體體腔,去除內(nèi)臟,將背側(cè)腸系膜及兩邊的生殖嵴從胚體背側(cè)撕下,用含高濃度雙抗的無菌PBS沖洗組織塊數(shù)次,將取出的組織切成1 mm3左右的小塊。將切碎的組織塊移入4個培養(yǎng)瓶內(nèi),兩瓶滴加少量培養(yǎng)液A, 兩瓶滴加少量培養(yǎng)液B。于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng),24 h后加入足量培養(yǎng)液。以后每2天半量換液,每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

        1.4   人EG細胞的傳代培養(yǎng)   挑選細胞已鋪滿瓶底的培養(yǎng)瓶,棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)液,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液1~2 ml消化細胞,2~4 min后,鏡下觀察,當人EG細胞集落開始分散形成由數(shù)個細胞組成的細胞團時,加入3 ml與原培養(yǎng)液相同的A或B培養(yǎng)液終止消化。用吹管將細胞吹打成單細胞懸液,吸出一半移入另一個培養(yǎng)瓶,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),次日換液。追蹤觀察傳代細胞的生長狀況。

        1.5   移植細胞的制備   移植前1 h,以無菌接種針挑取傳代培養(yǎng)至第4代人EG細胞集落,0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化[3],待細胞發(fā)生胞質(zhì)回縮,細胞集落分散開時,即加含血清培養(yǎng)基終止消化,用吸管反復(fù)輕輕吹打瓶底,使細胞成為均勻的單細胞懸液,用無菌PBS離心洗滌2次,將細胞吹打均勻,計數(shù)板計數(shù),調(diào)密度至1×106/ml。以微量注射器吸取50 μl,置4 ℃待用。

        1.6   實驗動物分組及心肌梗死模型制作   將體重200~250 g SD大鼠40只隨機分為2組:(1)急性心肌梗死+人EG細胞(AMI+hEGcs, n=28);大鼠心肌梗死后在梗死區(qū)邊緣分四點注射各點注入12 μl細胞懸液;(2)急性心肌梗死對照組(AMI+PBS,n=12):大鼠心肌梗死后在梗死區(qū)邊緣分4點注射各點注入12 μl PBS。具體步驟參照 文獻 [4]。建模成功后即在心肌梗死區(qū)邊緣用微量注射器分4點注射,各點注入12 μl人EG細胞懸液,密度為1×106/ml,對照組以同樣方法注入等量的無菌PBS。關(guān)胸,維持輔助呼吸至自主呼吸恢復(fù),送回籠中飼養(yǎng)。術(shù)后肌肉注射青霉索40 U以預(yù)防感染,并在30 ℃條件下蘇醒。全手術(shù)過程為無菌操作,術(shù)后不需拆線。

        1.7   免疫組織化學(xué)法鑒定   移植后1 d、1、2、4周,分別取7只移植組和3只對照組大鼠,用4%水合氯醛腹腔注射麻醉,取出心,PBS沖洗血液,去除左右心房和右心室,將左心室部位用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,石蠟切片采用二步法進行免疫組織化學(xué)標記,一抗分別為鼠抗人細胞核單抗(1∶100,MAB1281),二抗為通用型二抗,顯微鏡下觀察。實驗嚴格按照說明書進行操作。

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